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通過冰芯取樣表征藥物瓶中的冷凍過程

更新時間:2024-11-22   點擊次數(shù):776次

 

通過冰芯取樣表征藥物瓶中的冷凍過程

 

摘要

原料藥 (DS) 的冷凍是一項關(guān)鍵的單元操作,可能會影響產(chǎn)品質(zhì)量,可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集和不可見顆粒的形成。冷凍濃縮已被確定為影響冷凍期間蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的關(guān)鍵參數(shù),因此應(yīng)盡量減少。宏觀冷凍濃縮(以下僅稱為冷凍濃縮)主要受冷凍速率的影響,而冷凍速率又受獨立于產(chǎn)品的工藝參數(shù)的影響,例如 DS 容器、其大小和填充水平以及冷凍設(shè)備。(大規(guī)模)工藝特性研究對于理解和優(yōu)化冷凍工藝至關(guān)重要。然而,評估冷凍濃縮需要對冷凍塊進(jìn)行取樣,這通常是通過將冰塊切成碎片進(jìn)行后續(xù)分析來完成的。此外,這些研究對大量產(chǎn)品的需求是一個主要限制。在這項研究中,我們報告了一種簡單的方法的開發(fā),該方法使用替代溶液在相關(guān)規(guī)模上對瓶中的冷凍 DS 進(jìn)行實驗表征。新型冰芯取樣技術(shù)確定中心的軸向冰芯可指示低溫濃縮,低溫濃縮通過滲透壓和組氨酸與聚山梨醇酯 80 (PS80) 的濃度來測量,而滲透壓則顯示是一種靈敏的讀數(shù)。最后,我們通過比較不同冷凍方案(-80°C vs -40°C)的低溫濃縮來舉例說明該方法研究 DS 瓶中低溫濃縮的適用性。冷凍過程中的延長應(yīng)激時間與 2 L DS 瓶軸向中心滲透壓量化的更高程度的低溫濃縮相關(guān)。

關(guān)鍵詞 低溫濃縮 · 藥物瓶 · 冷凍保存 · 大規(guī)模冷凍 · 工藝表征

 

介紹

在生物制藥制造中,原料藥(DS) 通常以批量方式冷凍,以提高儲存穩(wěn)定性并大程度延長保質(zhì)期。儲存的目標(biāo)冷凍溫度通常為 -20°C、-40°C 或 < -65°C,并且不同公司的冷凍/解凍 (F/T) 設(shè)備、規(guī)程和目標(biāo)溫度可接受范圍通常不同。冷凍 DS 可以長期穩(wěn)定 DS,降低生物負(fù)荷控制(因此為非無菌)DS 中任何潛在微生物生長的風(fēng)險,并避免 DS 和藥物產(chǎn)品 (DP) 的累積穩(wěn)定性。此外,冷凍 DS 還可以將 DS 與 DP 制造分離,同時提高 DP 生產(chǎn)的靈活性。另一方面,生物 DS 的冷凍和隨后的解凍可能會引發(fā)物理不穩(wěn)定性,這可能會影響產(chǎn)品質(zhì)量,導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集和顆粒。為了減少 F/T 相關(guān)壓力和對產(chǎn)品質(zhì)量的潛在影響,需要了解 F/T 操作,以充分設(shè)計和控制這些關(guān)鍵工藝步驟。

冷凍過程尤其會對產(chǎn)品穩(wěn)定性產(chǎn)生不利影響。已發(fā)現(xiàn)各種應(yīng)力條件可能會在冷凍過程中破壞蛋白質(zhì)制劑的穩(wěn)定性,包括冰/液界面處的表面誘導(dǎo)降解以及與冷凍濃縮(也稱為冷凍濃縮)相關(guān)的不同條件。微觀冷凍濃縮是指溶質(zhì)在冰晶之間微觀空間中的必然濃縮,而宏觀冷凍濃縮則描述了溶質(zhì)在宏觀層面(厘米級)上的運輸。

宏觀冷凍濃縮發(fā)生在溶液冷凍過程中,此時溶質(zhì)被排除在不斷增長的冰之外并逐漸濃縮,導(dǎo)致在達(dá)到玻璃化轉(zhuǎn)變溫度 (Tg’) 之前達(dá)到最大冷凍濃度,即整個系統(tǒng)凝固。這種宏觀冷凍濃縮(下文中將簡稱為冷凍濃縮)可能通過不同的機制導(dǎo)致蛋白質(zhì)制劑不穩(wěn)定,包括輔料結(jié)晶可能導(dǎo)致 pH 值變化、離子強度增加以及緩沖劑與蛋白質(zhì)之間的特定比例變化。值得注意的是,導(dǎo)致蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的各種冷凍相關(guān)降解機制是配方和蛋白質(zhì)有的,通常無法相互區(qū)分。盡量減少冷凍濃縮,從而在冷凍期間和冷凍后實現(xiàn)更均勻(同質(zhì))的濃度分布是可取的,這也被認(rèn)為有利于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。

最重要的是,冷凍濃縮受多個產(chǎn)品和配方獨立工藝參數(shù)的強烈影響,例如冷凍設(shè)備、容器類型、幾何形狀和填充水平。這是因為這些參數(shù)會影響冷凍速率和冷凍方向。因此,可以獨立于活性藥物成分 (API) 進(jìn)行表征冷凍濃縮的工藝特性研究,例如通過使用替代配方。建議在代表性配置和規(guī)模下進(jìn)行研究,即在 DS 瓶中。冷凍對產(chǎn)品質(zhì)量的影響,即研究產(chǎn)品相關(guān)參數(shù),可以在模擬所需低溫濃縮的合適小規(guī)模模型中進(jìn)行,因為大量 DS材料的可用性通常是制造規(guī)模工藝特性研究的主要限制。

無論使用何種冷凍工藝和設(shè)備,都必須很好地表征該工藝,以便理想地使用不同的冷凍和解凍速率。與 DS 袋不同,由于缺乏市售的活性 F/T 系統(tǒng),以及在擴大規(guī)模過程中與幾何相關(guān)的工藝挑戰(zhàn),DS 瓶中的控制冷凍尤其具有挑戰(zhàn)性。簡而言之,增加瓶子尺寸會導(dǎo)致表面與體積比降低,這會嚴(yán)重影響熱交換,減慢冷凍過程并可能增加冷凍濃縮。因此需要很好地了解不同規(guī)模的冷凍過程。

與 F/T 研究不同,在 F/T 研究中可以在冷凍和解凍后甚至在多次 F/T 循環(huán)后收集和分析液體樣品,而冷凍過程本身的表征需要對冰塊進(jìn)行取樣,以便分析冷凍狀態(tài)下的冷凍濃度。這些冷凍取樣程序通常費力且耗時,需要特定工具將冰塊切成隨后可進(jìn)行分析的碎片。先前的研究通常使用帶鋸切割冰塊,而其中一些研究還報告了與這些程序相關(guān)的具體挑戰(zhàn) [31–33],總體而言,此類研究通常僅包括少數(shù)實驗條件和很少或沒有實驗重復(fù)。

與之前專注于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的冷凍研究相比,我們開發(fā)了一種簡單、快速的方法來研究冷凍狀態(tài)下的低溫濃縮并評估與產(chǎn)品無關(guān)的工藝參數(shù),例如冷凍設(shè)備、冷凍機類型、冷凍目標(biāo)溫度、容器類型、容器大小等。在本研究中,我們提出了一種新穎的采樣技術(shù),通過冰芯鉆孔結(jié)合替代溶液的使用,可以表征 DS 瓶中的冷凍過程,從而確定進(jìn)一步研究的關(guān)鍵工藝參數(shù)。取樣從 DS 瓶的頂部進(jìn)行,并進(jìn)一步優(yōu)化,以通過僅取樣相關(guān)位置來減少取樣工作量。替代溶液中溶質(zhì)的低溫濃縮程度通過滲透壓、組氨酸和 PS80 含量來量化。為了舉例說明該方法,我們比較了在 -40°C 與 -80°C 靜態(tài)冷凍條件下 2 L DS 瓶中的低溫濃度,以證明區(qū)分不同冷凍方案的適用性。

 

材料和方法

樣品制備

制備了代表標(biāo)準(zhǔn)單克隆抗體 (mAb) 配方的替代溶液,該替代溶液包含 20 mM L-組氨酸緩沖液、240 mM 蔗糖、10 mM L-蛋氨酸和 0.04% 聚山梨醇酯 80 (PS80),pH 值為 5.5(Tg’ -34°C,~ 1.3 cP)。L-組氨酸、L-組氨酸 HCl、L-蛋氨酸和 PS80(J.T. Baker)從 VWR(瑞士迪提康)購買,蔗糖從 Pfanstiehl(瑞士祖格)購買。使用從 VWR(瑞士迪提康)購買的 0.22 µm PVDF 過濾器對制備的替代溶液進(jìn)行無菌過濾。

將 2 L 替代溶液裝入 SaniSure(盧森堡巴沙拉日)提供的 2 L 聚碳酸酯 PharmaTainer™ 瓶中,并在 Thermo Fisher Scientific(美國北卡羅來納州阿什維爾)的 -80°C 超低溫 (ULT) 冰箱 Revco™ (RDE50086FV) 或 Snijders Labs(荷蘭蒂爾堡)的 -40°C 低溫冰箱 (VF360-45G) 中被動冷凍。

在開始實驗運行之前,將單個 DS 瓶放置在空冰箱底架的中央,并將門打開時間為 1 分鐘。

 

Ice Core Sampling 冰芯取樣

如圖 1 所示,使用冰芯鉆孔技術(shù)對冷凍取樣獲得的樣品進(jìn)行冷凍后溶液成分的低溫濃縮分析。

連續(xù)使用兩種不同的設(shè)置。第一種設(shè)置每瓶收集三個軸向冰芯(圖 1a)進(jìn)行橫截面分析。對于邊緣(E)和半徑向距離(H)冰芯位置的取樣,在冷凍前將瓶子的上部切掉并用膠帶緊緊封閉。優(yōu)化的設(shè)置(圖 1b)僅通過瓶口收集瓶子徑向中心的冰芯。頂部的第一個樣品總是用直徑為 21 毫米的不銹鋼手動取芯器手動取出,取樣深度約為 20 毫米,以標(biāo)記后續(xù)機器鉆孔的位置。

為了在冰芯中鉆孔,將瓶子緊緊固定在虎鉗中,并使用配備不銹鋼芯鉆(內(nèi)徑:16 毫米,外徑:21 毫米,長度:200 毫米)的電鉆機(SFS Group,瑞士 Heerbrugg)進(jìn)行鉆孔,該鉆機來自 Bürkle GmbH(德國巴特貝林根)。使用樣品彈出器附件將冰芯從空心芯鉆中輕輕取出,并放置在干凈的工作表面上,預(yù)先標(biāo)記好 25 毫米的部分(圖 1c)。將樣品分離并轉(zhuǎn)移到試管中進(jìn)行解凍,并從底部開始編號。由于冷凍后在冷凍塊中心存在冰山,因此收集的樣品數(shù)量從 11 到 13 不等。此外,由于瓶子中心的凹形,H 和 E 軸上的鉆孔深度略深。為了消除采樣程序(開放式處理)中潛在的外部顆粒污染,樣品解凍后用 5.0 µm PVDF MillexSV 注射器過濾器(Merck,瑞士 Buchs)進(jìn)行過濾,然后儲存在 -80°C 下直至分析。

 

溫度曲線

在一個案例研究中,應(yīng)用兩種不同的冷凍方案,即冷凍至 -80°C(RDE50086FV Revco™ ULT 冷凍機)或 -40°C(VF360-45G 低溫冷凍機),在冷凍過程中記錄了溫度曲線。

對于進(jìn)行冰芯鉆探的 DS 瓶,使用 Testo(瑞士門夏爾特多夫)的 Pt-100 溫度探頭記錄 DS 瓶外部的溫度(見圖 1b)。作為對照,使用相同的溫度映射設(shè)置記錄了單獨的對照瓶中的溫度曲線,但在液體中放置了額外的 Typ-T 熱電偶(來自 TC GmbH)(見圖 2),以便將對照瓶的溫度曲線與用于冰芯采樣的瓶子的溫度曲線進(jìn)行比較。通過比較可以將對照實驗中估計的應(yīng)力時間轉(zhuǎn)移到用于冰芯鉆探的 DS 瓶中。對于控制溫度測量,將熱電偶放置在第一個凍結(jié)點 (FPF) 和最后一個凍結(jié)點 (LPF) 處,并使用相同的凍結(jié)方案進(jìn)行凍結(jié)。對于本研究中使用的配置(被動凍結(jié)一個裝滿 2 L 的 2 L DS 瓶),F(xiàn)PF 和 LPF 分別位于邊緣底部和徑向中心,液位高度約為 1.5 L,如先前確定的。

分析溫度曲線,從兩個獨立的溫度映射實驗中評估應(yīng)力時間的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差,作為 FPF 處 < 0°C 到 LPF 處 -34°C 之間的時間跨度,即替代溶液的 Tg'。

 

 

img1 

 

圖 1 冷凍 DS 瓶中冰芯取樣技術(shù)和溫度監(jiān)測示意圖。a 橫截面分析:在不同徑向位置(瓶子的側(cè)面和頂視圖)取樣三個冰芯,即在中心 [C]、半徑向距離 [H] 和邊緣 [E]。b 中心芯分析:通過瓶口取樣中心芯。溫度探頭連接在瓶子外部,用于在冷凍期間記錄溫度。c 帶有冰芯樣品彈出器的冰芯鉆頭和彈出的冰芯,分成 25 毫米長的樣品

img2 

圖 2 DS 瓶內(nèi)的溫度測繪裝置示意圖,用于記錄第一個凍結(jié)點 (FPF)、最后一個凍結(jié)點 (LPF) 和瓶外的溫度

 

溫度數(shù)據(jù)由 OMEGA Engineering GmbH(德國 Deckenpfronn)的 RDXL6SDUSB 數(shù)據(jù)記錄器記錄,并使用 Origin Lab 軟件版本 2023(OriginLab Corporation,美國馬薩諸塞州北安普敦)進(jìn)行評估。

 

分析方法

滲透壓

滲透壓濃度通過凝固點降低測量,使用 Gonotec 的 Osmomat 3000 儀器,該儀器由 Haslab GmbH(瑞士比爾本肯)訂購。樣品在校準(zhǔn)范圍內(nèi)測量三次,范圍在 0 mOsmol/Kg 和 850 mOsmol/Kg 之間。如果需要進(jìn)行分析,樣品用水稀釋。

 

PS80 量化

PS80 通過 Brito & Vaz 描述的 HPLC-熒光膠束測定法進(jìn)行定量分析。簡而言之,根據(jù) Schmidt 等人的方法測量未稀釋的樣品。使用 Waters Acquity Arc Premier 系統(tǒng)(瑞士巴登)與 Waters 2475 熒光檢測器(瑞士巴登)耦合。使用 0.004% 至 0.1% 之間的校準(zhǔn)范圍,如果需要,用水稀釋樣品。

 

組氨酸定量

采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳 (CZE) 方法對組氨酸進(jìn)行定量分析,所用設(shè)備為 SCIEX PA800plus 系統(tǒng)(Brea;美國),該系統(tǒng)配備有紫外檢測器、214 nm 濾光片(SCIEX)、溫控自動采樣器和 30 kV 電源。測量采用 Molex(Lisle;美國)的熔融石英毛細(xì)管進(jìn)行,其內(nèi)徑為 30 µm,長度為 20/30 cm。在一個序列中,樣品儲存在 10°C 的自動采樣器中。對于分離緩沖液,使用 150 mM 磷酸鹽溶液(pH 1.5)與 5% IPA 混合。在注入樣品之前,用 1 M HCl、H2O 和背景電解質(zhì)沖洗毛細(xì)管,或每次在 50 psi 下沖洗三分鐘。通過三次標(biāo)準(zhǔn) CZE 運行和一個空白,使新鮮的毛細(xì)管平衡以適應(yīng)分離緩沖液條件。分離電壓設(shè)定為 +28 kV。使用的校準(zhǔn)范圍為 1 至 100 mM 組氨酸,并向每個樣品中添加 20 mM 4-氨基苯甲酸作為內(nèi)標(biāo)。

 

數(shù)據(jù)評估

低溫濃縮分析結(jié)果以濃度因子表示,其計算方法是將樣品濃度除以替代溶液的初始濃度。使用 OriginPro 2023 版(OriginLab Corporation,美國馬薩諸塞州北安普頓)對數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化。

結(jié)果與討論

DS 瓶中的低溫濃度分布圖

建立了冰芯取樣方法,以研究裝有 2 L 替代溶液的 2 L DS 瓶中的低溫濃縮,該替代溶液代表 mAb 配方。在第一個設(shè)置中(圖 1a),在從三個軸向冰芯收集的樣品中確定了在 -80°C 下冷凍后 2 L 瓶中溶質(zhì)的分布。滲透壓(圖 3a)被測量為一個依數(shù)參數(shù),代表替代溶液中的組氨酸和蔗糖濃度;組氨酸(圖 3b)被量化為緩沖系統(tǒng)和可能的 pH 平衡的變化指標(biāo),PS80(圖 3c)被量化為生物制劑配方中穩(wěn)定界面應(yīng)力的關(guān)鍵賦形劑。對于所有三個測試的配方參數(shù),冷凍本體中的溶質(zhì)分布闡明了朝向冰丘底部中心和頂部的鐘形濃度分布。

之前在不同研究中觀察到了溶質(zhì)的鐘形濃度,這些研究采用了類似的條件但不同的采樣技術(shù) 。例如,將 mAb 制劑在圓形 1 L HDPE 瓶中冷凍至 -70°C(通過滲透壓和 mAb 濃度量化)后,其濃度呈鐘形。同樣,對于不同的冷凍方案,Kolhe 及其同事報告了瓶中冷凍的鐘形濃度曲線,而冷凍至 -40°C 和 -20°C 產(chǎn)生的冷凍濃縮程度高于冷凍至 -70°C 的瓶子。Duarte 等人 使用了與本研究中介紹的類似的裝置。他們將裝滿牛血清白蛋白 (BSA) 溶液的 2 L 矩形 DS 瓶冷凍至 -75°C,但使用了帶有強制空氣對流的干冰室。作者報告稱,與本文中提出的替代溶液的結(jié)果相比,2 L 瓶內(nèi)的 BSA 分布情況相當(dāng),并且還發(fā)現(xiàn),與前面提到的 Kolhe & Badkar 的研究相反,頂部存在高度濃縮的區(qū)域 。Padala 等人在 -30°C 的步入式冷凍柜中冷凍 10 L 玻璃瓶中的 8.5 kg BSA 溶液后,分析了 BSA 的低溫濃縮情況,甚至發(fā)現(xiàn)頂部的濃度最高。

 

img3 

圖 3 a-c 在 -80°C 冰箱中被動冷凍后,2 L DS 瓶中 2 L 替代溶液的中心核心采樣的代表性橫截面輪廓圖和 d-f 條形圖。數(shù)字表示 a、d 滲透壓、b、e PS80 和 c、f 組氨酸的濃度因子。輪廓圖和條形圖使用相同的顏色標(biāo)度進(jìn)行視覺比較。對于 d-f,數(shù)據(jù)表示為兩個實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差

 

在停滯空氣條件下(標(biāo)準(zhǔn) ULT 冷凍機),瓶內(nèi)被動冷凍預(yù)計會以從外到內(nèi)的徑向冷凍幾何形狀發(fā)生,這與冰丘的形成有關(guān)。這些冰丘是由于冷凍過程中體積膨脹而形成的,這導(dǎo)致因徑向冷凍而滯留在中心的濃縮液體被向上推到頂部。

除了不在本研究范圍內(nèi)的配方相關(guān)參數(shù)(例如粘度、Tg’)外,已知與工藝相關(guān)的參數(shù)(例如冷卻速率、熱流方向、容器幾何形狀和填充水平)對冷凍后溶質(zhì)的分布曲線有重大影響。事實上,這些參數(shù)影響溶質(zhì)的對流質(zhì)量流與被滯留在不斷增長的冰中的溶質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間的相互作用,這最終決定了冷凍塊中溶質(zhì)的分布。例如,凍結(jié)鋒速度首先影響冰鋒的形態(tài),而冰鋒的形態(tài)決定了被困在冰中的溶質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù);其次,溶質(zhì)離開冰鋒的運動由液相中的擴散和對流決定。因此,快速凍結(jié)被描述為減弱冷凍濃縮的程度。

總之,鐘形低溫濃度分布被認(rèn)為是 DS 瓶中典型的徑向和慢速冷凍幾何形狀的結(jié)果。僅部分被困在徑向生長的冰中的溶質(zhì)被連續(xù)輸送到中心,而未凍結(jié)液體中的密度梯度(由溫度梯度引起)促進(jìn)自然對流,將溶質(zhì)向下拖拽的速度高于沿徑向中心向上輸送的速度 。容器幾何形狀和熱流方向決定了形成的冰幾何形狀,從而決定了尚未凝固的液體的剩余空間,溶質(zhì)在其中發(fā)生對流運動。由于被動冷凍 DS 瓶中溶質(zhì)的分布分布是徑向冷凍幾何形狀的結(jié)果,因此高濃度區(qū)域預(yù)計沿垂直軸。

因此,我們選擇瓶子中的軸心作為分析低溫濃度和優(yōu)化冰芯鉆探裝置 1 的代表區(qū)域(圖 1a)。優(yōu)化設(shè)置 2(圖 1b)僅從軸心芯收集樣本,其中包括最后凝固的代表性中心區(qū)域。在優(yōu)化設(shè)置中,冰芯通過瓶口取樣,如圖 1b 所示,無需切掉瓶子的頂部。

與僅分析中心芯的優(yōu)化設(shè)置(圖 3d-f)相比,橫截面分析報告的溶質(zhì)濃度(圖 3a-c)產(chǎn)生了類似的結(jié)果。橫截面分析中的最高濃度位于最底部的中心(位置 1 圖 3d-f),而對于優(yōu)化設(shè)置(中心芯分析),最高溶質(zhì)濃度可重復(fù)地發(fā)現(xiàn)略高于底部(位置 2 圖 3d-f)。在冷凍過程中,橫截面分析中瓶子的頂部被切掉并用膠帶固定,這意味著瓶子在設(shè)置 1 中不是氣密的/壓力密封的。與最終優(yōu)化設(shè)置中未經(jīng)操作的瓶子相比,瓶子的操作可能解釋了橫截面分析中最高溶質(zhì)濃度位置的輕微變化。與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)一致,我們的研究結(jié)果證實,瓶子中冷凍塊體徑向軸的中心核既反映了濃度熱點(即頂部和底部附近的最大冷凍濃度),也覆蓋了低濃度區(qū)域,例如頂部高濃度部分的下方。

已證明與冷凍過程相關(guān)的不穩(wěn)定性是冷凍濃縮產(chǎn)生不均勻冷凍基質(zhì)的結(jié)果。在濃度較低的區(qū)域、賦形劑和蛋白質(zhì)之間比例發(fā)生變化的區(qū)域以及頂部的冰丘區(qū)域 都觀察到了降解。與直覺相反,這意味著蛋白質(zhì)降解通常不會發(fā)生在冷凍塊中冷凍濃度最高的區(qū)域。

因此,中心核心被認(rèn)為是預(yù)測 DS 瓶中冷凍濃縮發(fā)生的指示性指標(biāo),因為它反映了冷凍濃縮的程度,覆蓋了瓶中低濃度和高濃度區(qū)域之間的廣泛范圍。然而,對于使用截然不同的冷凍工藝(例如,可能對瓶中的冷凍幾何形狀產(chǎn)生影響,如氣流冷凍機的情況)的瓶子,建議對瓶子進(jìn)行擴展分析,以確認(rèn)中心軸仍然反映瓶子內(nèi)相關(guān)的感興趣區(qū)域。值得注意的是,通過瓶子開口取樣的中心核心的優(yōu)化設(shè)置不需要操縱瓶子,并且大大降低了取樣程序的復(fù)雜性和時間。

 

不同溶液成分的低溫濃縮

為了研究冷凍濃縮,我們分析了滲透壓并量化了替代溶液樣品的 PS80 和組氨酸濃度,并將結(jié)果報告為濃縮因子。對于兩種采樣裝置的三個讀數(shù),確定了相似的濃縮因子,如圖 3a-c 和 d-f 所示。定量地看,滲透壓和組氨酸的趨勢產(chǎn)生了可比的濃縮因子,與 PS80 的濃縮因子相比略高。根據(jù)替代溶液的成分,滲透壓主要反映溶液中的組氨酸和蔗糖濃度。

有趣的是,文獻(xiàn)中的幾項研究報告稱,配方輔料(例如糖和緩沖鹽)的濃縮程度通常比蛋白質(zhì)更高,這主要歸因于這些分子的不同擴散系數(shù)。在 Bluemel 等人的研究中,在含有 PS80 的組氨酸緩沖液中配制的 mAb 在 2 L 瓶中冷凍至 -40°C。對冷凍塊中低溫濃縮的分析表明,與溶液中的 mAb 和 PS80 相比,組氨酸的濃縮程度更高。濃縮程度確實與這三種成分的測量擴散系數(shù)相關(guān)。有趣的是,mAb 和 PS80 的濃縮程度相似,這可以通過 PS80 膠束和 mAb 分子的擴散系數(shù)相似來解釋。然而,不能排除 PS80 作為一種傾向于與表面(冰/液體表面)相互作用的表面活性分子,其行為可能與其他小分子成分不同,但更相似,就像蛋白質(zhì)也是兩親分子一樣。

其他作者描述說,對流驅(qū)動的溶質(zhì)運動主導(dǎo)了擴散的影響,因此得出結(jié)論,化合物擴散系數(shù)的差異可以忽略不計。

Weber 和 Hubbuch 通過時間分辨在線拉曼光譜從機制上研究了溶液中不同成分的低溫濃縮過程。簡而言之,凍結(jié)前沿剩余液相中溶質(zhì)的質(zhì)量傳輸是分子對流和擴散運動之間復(fù)雜相互作用的基礎(chǔ),這種相互作用受上述過程相關(guān)參數(shù)的影響,也受決定分子流動性的溶液特性(如其特定的擴散系數(shù)和粘度)的影響。

因此,可以假設(shè)溶液中的小分子濃縮到更高的程度,這與本研究通過單獨觀察組氨酸濃度或通過滲透壓作為組氨酸和蔗糖的累積參數(shù)觀察到的結(jié)果一致。因此,我們將滲透壓視為一種靈敏的讀數(shù),以研究 DS 瓶中的冷凍濃縮與冷凍過程的關(guān)系。

增加粘度可以通過限制溶液內(nèi)的自然對流和擴散來抵消冷凍濃縮的影響,這種影響甚至在冷卻時會加劇,正如 Bluemel 等人所展示的那樣。我們還可以使用我們的裝置研究粘度對最終冷凍濃縮的影響。本研究中使用的替代溶液具有相對較低的粘度,代表了一種靈敏的裝置,經(jīng)過優(yōu)化可研究工藝參數(shù)。

總之,盡管 PS80 的冷凍濃縮可能對蛋白質(zhì)分子具代表性,但為了研究冷凍濃度與冷凍過程參數(shù)的關(guān)系,滲透壓(在我們的配方中主要代表組氨酸和蔗糖)是靈敏的讀數(shù),同時與單個成分的含量分析相比,它是一種快速而簡單的分析方法。

 

案例分析

我們采用優(yōu)化的冷凍取樣方法研究了不同冷凍方案(即不同的目標(biāo)冷凍溫度 -40°C 和 -80°C)下 2 L DS 瓶中替代溶液的冷凍濃縮。

我們使用傳統(tǒng)的 -40°C 冷凍機故意誘導(dǎo)更長的應(yīng)力時間,而 -80°C 冷凍由于溫差較低而延長了達(dá)到 Tg' 以下溫度的時間跨度。應(yīng)力時間是從冰核開始到達(dá)到 Tg'(冷凍基質(zhì)凝固)的時間跨度。在此時間跨度內(nèi),液相中的溶質(zhì)不斷濃縮,因此應(yīng)力時間可視為冷凍過程中冷凍濃縮的指標(biāo)。

我們根據(jù)圖 2 所示的設(shè)置通過溫度映射表征了兩種冷凍方案,并確定了在 -80°C 和 -40°C 下冷凍的應(yīng)力時間分別為 4.9 小時(± 0.2)和 11.2 小時(± 0.2)。圖 4 顯示了采樣瓶(經(jīng)過冰芯采樣)外部記錄的代表性溫度曲線和相應(yīng)溫度。采樣瓶外部記錄的溫度曲線與溫度映射實驗的相應(yīng)曲線相匹配,證明了冷凍程序的可重復(fù)性,從而證明了用于估計實際采樣瓶中應(yīng)力時間的溫度數(shù)據(jù)的有效性。

冷凍濃度通過滲透壓定量(圖 5)。在 -40°C 下冷凍與在 -80°C 下冷凍相比,產(chǎn)生的濃度曲線不同。在 -40°C 下冷凍的瓶子承受的壓力時間是其 2 倍多,導(dǎo)致冷凍濃縮程度更高,而且濃縮的底部區(qū)域沿著中心核心分布在更寬的區(qū)域。因此,我們確認(rèn)冷凍替代溶液的中心核心采樣方法結(jié)合滲透壓讀數(shù)是一種靈敏的方法,可以表征和區(qū)分冷凍方案并研究 2 L DS 瓶中的冷凍濃度。

 

img4 

圖 4 在 a -80°C 冰箱和 b -40°C 冰箱中,2 L DS 瓶中 2 L 替代溶液被動冷凍的代表性溫度曲線。記錄了進(jìn)行冰芯采樣的瓶子的溫度曲線(紫線),并將其與對照實驗記錄的溫度曲線疊加。在相同條件和冷凍方案下冷凍的對照瓶的溫度曲線記錄在瓶子外部(紅線),以及第一個冷凍點 (FPF)(紅色虛線)和最后一個冷凍點 (LPF)(紅色虛線)

 

img5 

 

圖 5 在 -40°C 冰箱中被動冷凍后,在 2 L DS 瓶中的 2 L 替代溶液的中心核心中分析的低溫濃縮,顯示為滲透壓的濃度因子

 

應(yīng)用和限制

在本研究中,我們報告了一種便捷方法的開發(fā),該方法使用替代溶液在相關(guān)規(guī)模上對 DS 瓶中的冷凍過程進(jìn)行實驗表征。將所提出的方法與以前報告的采樣技術(shù)進(jìn)行比較,幾乎所有的冷凍研究都采用冷凍采樣,即使用帶鋸將冷凍塊切成小方塊。這些程序通常需要首先將容器與冷凍塊分離,然后沿三維軸逐片切割冷凍塊或從預(yù)切切片中取出核心樣本,最終獲得大小相同的樣品塊。在實踐中,這個過程很費力,因此很耗時,并且需要特定的設(shè)備和設(shè)施。此外,以前報告的程序仍然存在一些挑戰(zhàn),例如需要預(yù)冷鋸片或在切割前將樣品存放在干冰上。此外,根據(jù)容器的表面材料,報告稱冷凍塊與容器的緊密粘附,這需要例如加熱接觸面以將冰從容器壁上分離。

然而,所有冷凍采樣技術(shù),包括我們的巖心鉆探技術(shù),都需要開放式處理,存在樣品受到外部污染(例如顆粒污染)的風(fēng)險。根據(jù)所采用的溶液(替代物或蛋白質(zhì)溶液)和分析方法,應(yīng)采用適當(dāng)?shù)臉悠分苽浞椒?。然而,像本研究中報告的技術(shù)一樣,采用更少的處理步驟并且對 DS 容器本身無損的采樣技術(shù)最終將減少來自環(huán)境和過程的潛在顆粒污染。

盡管通常沒有明確提及,但采樣程序本身被認(rèn)為對結(jié)果有重大影響,特別是對冷凍濃縮的程度,通常報告為與初始濃度相比的濃度因子。通過冷凍采樣確定冷凍濃度在很大程度上取決于采樣冰塊的大小,正如之前提到的。值得注意的是,冷凍采樣方法總是描述宏觀的,而不是微觀的冷凍濃縮,因此從冷凍塊中收集的樣品的大小/體積肯定決定了樣品的稀釋程度。例如,在高濃度區(qū)域收集的較小尺寸的樣品會產(chǎn)生更高的最大濃度,這在概念上可以描述為方法的“分辨率"。在數(shù)據(jù)解釋和實驗設(shè)計中,應(yīng)考慮這種不可避免的樣本量依賴性限制。這意味著,使用不同采樣設(shè)置和配置的不同研究的結(jié)果不能直接相互比較,并且采樣技術(shù)從冷凍批量中收集相同大小的樣品的能力至關(guān)重要,即使樣本大小的某些變化是不可避免的,例如由于冰結(jié)構(gòu)和成分的變化。本研究開發(fā)的技術(shù)通過仔細(xì)選擇鉆井設(shè)備的尺寸并隨后分離冷凍樣品,有助于生成小樣本。

由于冷凍過程主要由與產(chǎn)品無關(guān)的工藝參數(shù)決定,例如如上所述的容器幾何形狀、尺寸和填充量,因此使用替代品(代替高價值的蛋白質(zhì)溶液)進(jìn)行工藝表征研究能夠表征冷凍過程,并允許在相關(guān)的代表性配置和規(guī)模(即在 DS 瓶中)下進(jìn)行實驗表征。使用替代溶液可以進(jìn)行大量獨立于產(chǎn)品的實驗和各種工藝參數(shù)的測試,從而能夠篩選和識別關(guān)鍵工藝參數(shù)。根據(jù)冷凍研究的目的,可以優(yōu)化替代溶液的性質(zhì),使其與特定產(chǎn)品的性質(zhì)相匹配,或與典型的 DS 溶液的性質(zhì)相匹配。在我們的研究中,我們選擇了一種具有典型配方成分的替代溶液,該替代溶液具有與冷凍濃縮相關(guān)的但最壞情況的性質(zhì)(低粘度和低 Tg'),以生成一個靈敏的設(shè)置來量化冷凍濃縮。對于以工藝參數(shù)為重點的工藝表征,滲透壓是一種簡單而有代表性的讀數(shù),用于指示替代溶液的冷凍濃縮的發(fā)生。

由于 DS 材料的可用性通常是制造規(guī)模工藝表征研究的主要限制,因此可以在合適的小規(guī)模模型中研究冷凍對產(chǎn)品質(zhì)量的影響,這些模型模擬預(yù)期濃度,例如在使用替代溶液進(jìn)行相關(guān)規(guī)模的補充實驗中確定的濃度。因此,了解冷凍過程和過程參數(shù)的相關(guān)性也使得選擇有意義且相關(guān)的條件進(jìn)行小規(guī)模產(chǎn)品質(zhì)量測試成為可能。

 

結(jié)論

冷凍和解凍是生物分子制造過程中的關(guān)鍵單元操作,必須對其進(jìn)行充分表征以盡量減少其對產(chǎn)品質(zhì)量的影響。

特別是冷凍過程可能會在整個冷凍 DS 中產(chǎn)生相當(dāng)大的不均勻性,這與許多不利條件有關(guān),例如賦形劑和蛋白質(zhì)濃度的變化、與自身相互作用傾向的潛在變化相關(guān)的離子強度變化或 pH 值的變化,這可能會影響聚集體形成和顆粒物等關(guān)鍵質(zhì)量屬性。

為了研究 DS 瓶中的低溫濃縮,我們報告了一種簡單的采樣方法,通過冰芯鉆孔使用滲透壓作為一種快速靈敏的讀數(shù),而不是以前耗時且復(fù)雜的冷凍采樣技術(shù)。我們的方法特別適合表征與產(chǎn)品無關(guān)的工藝參數(shù),例如比較冷凍設(shè)備或冷凍方案,如案例研究中所示。使用替代溶液可以在足夠高的分辨率下篩選制造規(guī)模的多個工藝參數(shù),以便識別關(guān)鍵工藝參數(shù),而無需大量蛋白質(zhì)溶液。

 

縮寫 API:活性藥物成分;BSA:牛血清白蛋白;C:中心;CZE:毛細(xì)管區(qū)帶電泳;DS:藥物物質(zhì);DP:藥物產(chǎn)品;E:邊緣;FPF:第一個冷凍點;F/T:冷凍/解凍;H:半徑向距離;LPF:最后一個冷凍點;mAb:單克隆抗體;PS80:聚山梨醇酯 80;Tg:玻璃化轉(zhuǎn)變溫度;ULT:超低溫

 


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